紙層析法是生物化學(xué)上分離、鑒定氨基酸混合物的常用技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性鑒定和定量測(cè)定。本文主要介紹了紙層析法分離鑒定氨基酸的實(shí)驗(yàn)原理、器材和具體操作步驟。
一、目的
通過氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方法。
二、原理
紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。
層析溶劑由有機(jī)溶劑和水組成。
物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf 值(比移)來表示的：
R=原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離
原點(diǎn)到溶劑前沿的距離
在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf 值是常數(shù)。Rf 值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法分離氨基酸。
三、器材
1、層析缸① 2、毛細(xì)管3、噴霧器4、培養(yǎng)皿
5、層析濾紙(新華一號(hào))
四、試劑
1、擴(kuò)展劑
是4 份水飽和的正丁醇和1 份醋酸的混合物。將20mL 正丁醇和5mL 冰醋酸放入分液漏斗中，與15mL 水混合，充分振蕩，靜置后分層，放出下層水層。取漏斗內(nèi)的擴(kuò)展劑約5mL 置于小燒杯中做平衡溶劑，其余的倒入培養(yǎng)皿中備用.
2、氨基酸溶液0.5%的賴氨酸、、頡氨酸、苯丙胺酸、亮胺酸溶液及它們的混合液(各組份濃度均為0.5%)。各5mL
3、顯色劑50~100mL
0.1%水合茚三銅正丁醇容液。
五、操作
1、將盛有平衡溶劑的小燒杯置于密閉的層析缸中。
2、取層析濾紙(長22cm、寬14cm)一張。在紙的一端距邊緣2~3cm處用鉛筆劃一條直線，在此直線上第間隔2cm 作一記號(hào)如右圖。
3、點(diǎn)樣用毛細(xì)管將各種氨基酸樣品分別點(diǎn)在這6 個(gè)位置上，干后再點(diǎn)一次。每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑zui大不超過3mm。
4、擴(kuò)展用線將濾紙縫成筒狀，紙的兩邊不能接觸。將盛有約20mL擴(kuò)展劑的培養(yǎng)皿建迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙直立于培養(yǎng)皿中(點(diǎn)樣的一端在下，擴(kuò)展劑的液面需你于點(diǎn)樣線1cm)。待溶劑上升15~20cm 時(shí)即取出濾紙，自然干燥或用吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)吹干。
5、顯色用噴霧器均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5 分鐘(100℃)或用熱風(fēng)吹干即可顯出各層析斑點(diǎn)。
6、計(jì)算各種氨基酸的Rf 值。
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