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明膠酶譜試劑盒使用注意事項大總結(jié)！

本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于 SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達1 nM，高于ELISA方法，其基本原理1 和程序是：制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳，電泳結(jié)束后 取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer 孵育，凝膠染色與脫色。

凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景， 但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能 同時指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué) 反應(yīng)緩沖液，可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性，檢測靈敏度~1nM。試劑 盒可進行50次標準小膠檢測，如果小膠加樣孔為10~15個，則總計可檢測500~750個樣品。

試劑盒使用注意：

1.制備聚丙烯酰胺時應(yīng)注意排除氣泡。

2.明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩沖液配制應(yīng)嚴格準確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。

3.用大梳子

4.孵育液的PH在7.5-7.6，復(fù)性的TRITON時間長了會有絮狀物，所以實驗時盡量使用新鮮配置的。

5.孵育的37度不要在CO2培養(yǎng)箱中，因為會改變孵育液的PH值，在普通孵箱即可。

6.細胞樣本用PBS 5倍體積震蕩裂解,估算細胞的體積，然后加入5倍體積的PBS，渦旋振蕩15-30s,而后靜置或低速離心.或者手動震蕩。

染色步驟：

1. 此染色液即為工作液，使用時直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝 膠，并緩慢搖動2h；

2. 傾去染色液，用脫色液沖洗凝膠；

3. 以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動2h，傾去脫色液，再加入新脫色液進行脫色，直至獲得清晰的藍色的條帶 和干凈的背景（通常此過程需要2～4h，也可脫色過夜至清晰的藍色的條帶和干凈的背景）；

4. 對凝膠進行分析和照相，凝膠可放置在7％的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置（P2000）對 凝膠進行處理后保存。 安全性：含有甲醇，無特殊毒性，按一般化學(xué)品操作規(guī)程處理。

明膠酶譜試劑盒使用注意事項大總結(jié)！